期刊信息
主办:中国中医科学院中药研究所;中华中医药学会
主管:国家中医药管理局
ISSN:1005-9903
CN:11-3495/R
语言:中文
周期:半月
影响因子:1.817375
数据库收录:
北大核心期刊(2008版);北大核心期刊(2011版);北大核心期刊(2014版);北大核心期刊(2017版);化学文摘(网络版);中国科学引文数据库(2015-2016);中国科学引文数据库(2017-2018);中国科学引文数据库(2019-2020);日本科学技术振兴机构数据库;中国科技核心期刊;期刊分类:中药学
期刊热词:
药理
淫羊藿苷通过提高自噬促进成骨细胞分化防治骨(6)
【作者】网站采编
【关键词】
【摘要】4 参考文献 References [1] 中华医学会骨质疏松和骨矿盐疾病分会. 原发性骨质疏松症诊疗指南(2017)[J].中华骨质疏松和骨矿盐疾病杂志,2017,20(5):413-443. [2] YAVR
4 参考文献 References
[1] 中华医学会骨质疏松和骨矿盐疾病分会. 原发性骨质疏松症诊疗指南(2017)[J].中华骨质疏松和骨矿盐疾病杂志,2017,20(5):413-443.
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0 引言 Introduction骨质疏松是指由于骨量减少、骨微结构退变导致骨骼强度下降、脆性增加以及易于发生骨折的一种全身性、代谢性疾病。随着社会老龄化加剧,骨质疏松的发病率正在逐年攀升,其相关并发症如骨折等严重威胁人们的生活质量[1]。目前,临床上用于治疗骨质疏松的药物大多以抑制破骨细胞的活性以及骨吸收为主[2],然而长期的抑制骨吸收将使破骨细胞处于“无应答”的状态[3],降低药物的疗效,因此提高成骨细胞的活性以及促进骨形成是更加理想的方法[4]。近年来,中药及其活性成分促进骨形成的研究报道日益增多,其中淫羊藿苷出现的频率最高[5],2017 年版《原发性骨质疏松症诊疗指南》中亦明确指出[1],在骨质疏松的中医药治疗中,淫羊藿苷是疗效确切的中药活性成分。研究指出淫羊藿苷能够激活骨重塑、促进骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化、抑制骨髓间充质干细胞的成脂分化,促进成骨细胞的成骨活性[6-7],但其抗骨质疏松的具体机制至今尚未完全明确。自噬是指真核细胞通过溶酶体途径对细胞质内的非功能性蛋白和细胞器进行降解以维持存活的过程,自噬在维持骨代谢平衡方面发挥着重要作用[8],其水平的改变是骨质疏松发病的重要原因[9-10]。研究指出自噬对成骨细胞的分化及矿化具有积极的意义[11],但淫羊藿苷对成骨细胞自噬存在怎样的影响目前尚缺乏研究报道,因此在此次研究中,课题组通过体内、体外实验探讨淫羊藿苷是否能通过影响自噬而防治骨质疏松。1 材料和方法 Materials and 设计 细胞及动物对比观察实验,分为3 个部分:①淫羊藿苷最佳浓度的筛选;②淫羊藿苷通过自噬促进成骨细胞分化;③动物实验 时间及地点 实验于2019 年7 月至2020 年3 月在广州中医药大学岭南医学研究中心骨伤科重点实验室以及广州中医药大学实验动物中心完成 材料1.3.1 细胞株 小鼠前体成骨细胞株MC3T3-E1 购自武汉Procell,货号:CL- 实验动物 6 月龄SPF 级雌性SD 大鼠24 只,体质量200-300 g,由广州中医药大学实验动物中心提供,实验动物质量合格证明编号:NO.44,实验动物许可证号编号:SCXK(粤)2018-0034,实验单位使用许可证编号:SYXK(粤)2018-0001。实验方案经广州中医药大学实验动物中心动物实验伦理委员会批准,批准号 药物 淫羊藿苷购于MACKLIN,货号:I,纯度≥98%,20 mg/?主要实验仪器 细胞超净工作台(苏州安泰空气技术有限公司);移液器、冷冻离心机(Eppendorf,德国);倒置相差显微镜(Leica,德国);全自动酶标仪、细胞培养箱(Thermo Fisher,美国);实时荧光定量PCR 仪(Applied Biosystems Inc,美国);多功能激光扫描成像系统(Amersham,英国);凝胶成像系统(上海天能科技,中国);Micro-CT(Encho-MRI/LCT-200,美国) 主要试剂 α-MEM 培养基(Hyclone,美国);磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffer saline,PBS)、胎牛血清、青链霉素、0.25%胰蛋白酶(Gibco,美国);β-甘油磷酸钠、抗坏血酸、地塞米松(Sigma,美国);碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)活性试剂盒(南京建成生物工程研究所,中国);ALP 染色试剂盒(碧云天生物技术有限公司,中国);茜素红粉剂(阿拉丁试剂有限公司,上海);细胞计数试剂盒(cell counting kit-8,CCK8)、ANNEXIN V-FITC/PI 凋亡试剂盒(索莱宝科技有限公司,北京);单丹磺酰戊二胺(Monodansylcadaverin,MDC)染色试剂盒(雷根生物技术有限公司,北京);3-甲基腺嘌呤(3-methyl adenine,3-MA,上海源叶生物,中国);戊酸雌二醇(拜尔医药保健有限公司,中国);细胞RNA 快速提取试剂盒、两步法荧光定量反转录PCR 试剂盒(Takara,日本) 实验方法1.4.1 淫羊藿苷最佳浓度的筛选 消化第3 代MC3T3-E1 细胞,将细胞分为对照组和淫羊藿苷不同浓度组(10-3,10-4,10-5,10-6mmol/L),进行以下测试:(1)CCK8 检测细胞增殖:消化第3 代细胞以3×103个/孔的密度接种于96 孔板,细胞分组同上,每组设置6 个复孔;接种24 h 待细胞贴壁后,弃去旧培养基,加入含淫羊藿苷的培养基,干预24,48,72 h 后弃去培养基,每孔加入100 μL混匀好的CCK8 溶液(将CCK8 溶液与培养基按照1 ∶9 的比例混匀),避光孵育2 h后用酶标仪在450 nm处测定吸光度(A)值,并计算细胞活力。(2)ALP 染色:消化第3 代细胞,以3×104个/孔的密度接种于24 孔板,细胞分组同上,每组4 个复孔,在培养箱中培养24 h;24 h 弃去培养基,加入含淫羊藿苷或不含淫羊藿苷的新鲜成骨诱导培养基(10 mmol/L 的β-甘油磷酸钠、50 μmol/L 抗坏血酸、10-8mol/L 地塞米松),每2 d 换液1 次;培养7 d 后按试剂盒步骤进行染色,扫描并显微镜拍照。(3)ALP 活性检测:消化第3 代细胞,以5×104个/孔的密度接种于24 孔板,细胞分组以及培养方法同“CCK8 检测细胞增殖”,于干预1,3,5,7 d 后弃去培养液,用裂解液裂解细胞后按照ALP 活性试剂盒的说明进行操作,计算金氏单位(U/mg)用以反映ALP 活性。(4)茜素红染色:消化第3 代细胞,以1×104个/孔的密度接种于24 孔板,细胞分组以及培养方法同“CCK8 检测细胞增殖”,培养21 d 后弃去培养液,用PBS 清洗3 遍,每次5 min,使用40 g/L的多聚甲醛固定30 min后弃去多聚甲醛,PBS 清洗3 遍,每孔加入300 μL(覆盖细胞)茜素红染色液,室温下染色10 min,PBS 清洗3 遍,扫描以及显微镜拍照。(5)ANNEXIN V-FITC/PI 凋亡检测:消化第3 代细胞,以1×104个/孔的密度接种于24 孔板,细胞分组以及培养方法同“CCK8 检测细胞增殖”,干预48 h 后,按照试剂盒说明进行操作。(6)实时荧光定量聚合酶链反应(RT-qPCR)检测:取第4代细胞,调整细胞密度至3×104个/cm2,每孔0.5 mL 接种于6 孔板中,补齐培养基至2 mL,然后置于37 ℃,体积分数5%CO2的培养箱中培养,细胞分组以及培养方法同上;24 h 后弃培养基,加入不同浓度的淫羊藿苷直至2 mL/孔,培养7 d,弃去培养液,用RNA 提取试剂盒提取总RNA,紫外分光光度计测定RNA 纯度,每组取1.0 μg 总RNA,分别加入反转录试剂盒的反应体系,在反转录仪中进行反转录生成cDNA 后,采用RT-qPCR 测定Runx2、Osterix、OCN、OPG 的表达情况,采用2-ΔΔCt法并以β-actin 为内参计算上述指标的相对表达量,用于统计学分析,引物序列见表1。表1 |引物序列Table 1 |Primer sequences of RT-qPCR基因名称 引物序列 产物长度Runx2 Forward:TGG CTT GGG TTTC AGG TTA G 104 bp Reverse:GGT TTC TTA GGG TCT TGG AGT G Osterix Forward:TGG AGA GGG AAA GGG ATT CT 97 bp Reverse:GAA ATC TAC GAG CAA GGT CTC C OCN Forward:AGT GAG GGT TAA GCA GGA ATA C 101 bp Reverse:CAG ACT AAG CTA AGA GCC CAA A OPG Forward:GCC GAG AGT GTA GAG AGG ATA A 105 bp Reverse:CTT CAC CAT TTC CTG GTC TCT G Collagen I Forward:AGA CCT GTG TGT TCC CTA CT 110 bp Reverse:GAA TCC ATC GGT CAT GCT CTC OPN Forward:AGT GAG GGT TAA GCA GGA ATA C 101 bp Reverse:CAG ACT AAG CTA AGA GCC CAA A ULK1 Forward:CAG GGT GGA CAC ATG CTA ATA C 104 bp Reverse:CAG CTT GTG GAC ACT CAG ATA C FIP200 Forward:CAG CAA GAG CGG GAT AAA GA 111 bp Reverse:ACT GCT AGT GCG GAG TTT AC ATG13 Forward:TCC ACC AGG CAA TTT GAG AG 89 bp Reverse:ATA GGA GAA GAG CTG GGA TAG G β-actin Forward:GAG GTA TCC TGA CCC TGA AGT A 104 bp Reverse:CAC ACG CAG CTC ATT GTA GA1.4.2 淫羊藿苷通过自噬促进成骨细胞分化的研究 消化第4代MC3T3-E1 细胞,将细胞分为3 组:对照组、淫羊藿苷组、淫羊藿苷+3-MA 组,后2 组用前面实验得出的最佳浓度淫羊藿苷处理细胞,淫羊藿苷+3-MA 组在此基础上加10 mmol/L自噬抑制剂3-MA ,进行以下测试:(1)MDC 染色:消化第4 代细胞,以3×103个/孔的密度接种于96 孔板,细胞同上分3 组,每组6 个复孔,待细胞贴壁后弃去培养基,加入含药或不含药的新鲜成骨诱导培养基,培养48 h;按照MDC Stain(×500):Stain buffer=1 ∶499的比例配制成MDC 染色工作液,每孔加入100 μL 的MDC 染色工作液,37 ℃,体积分数5%CO2避光孵育60 min,弃去工作液,加入Wash buffer 清洗3 遍,荧光显微镜下观察(激发滤光片波长355 nm,阻断滤光片波长512 nm)。(2)RT-qPCR:细胞分组以及培养方法同“MDC 染色”,余步骤同“1.4.1 中(6)”,检测指标为Runx2、OCN、Collagen I、OPN、ULK1、FIP200、ATG13,引物序列见表1。(3)免疫印迹(Western-Blotting):收集第4 代细胞,制成细胞浓度为1×108L-1的细胞混悬液,加2 mL 到6 孔板中,细胞分组以及培养方法同“MDC 染色”,置37 ℃,体积分数5%CO2培养过夜,7 d 后分别提取各组细胞总蛋白,12 000 r/min离心15 min,取上清100 μL,蛋白定量,配制样品,通过上样、电泳、转膜、封闭、孵育一抗二抗后显影,测出相应灰度值进行分析 动物实验(1)动物分组方法:SD 大鼠24 只分为4 组,假手术组、病理模型组、淫羊藿苷组、戊酸雌二醇组,每组6 只。打开Excel,利用升序排序,首先将所有SD 大鼠按体质量由小到大编号,利用Excel 生成24 个两位整数的随机数,将所得的两位随机数除以4,余数为0 放在假手术组,余数为1 的放在病理模型组,余数为2 的放在淫羊藿苷组,余数为3 的放在戊酸雌二醇组,如果余数为0 的那一组动物数已经达到6只,则将下次余数为0 的动物分配至第二组,其他同理,按照这种分组方法,一般情况下,得到的各组动物在体质量方面均无差异。(2)造模及给药:采取双侧卵巢切除术构建动物模型,具体步骤同前期研究[15];术后连续3 d 肌注青霉素钠,然后开始给药进行干预;淫羊藿苷溶解在0.5%的羧甲基纤维素钠中,戊酸雌二醇以生理盐水直接溶解;淫羊藿苷以200 mg/(kg·d)的剂量进行灌胃,戊酸雌二醇以0.1 mg/(kg·d)剂量灌胃,假手术组和病理模型组予以等量生理盐水灌胃,疗程为12 周。动物造模目的、技术方法等相关问题造模目的: 观察淫羊藿苷对骨质疏松大鼠股骨自噬相关蛋白ULK1、FIP200、ATG13 表达的影响借鉴已有标准动物模型造模:参考文献[15]建立骨质疏松大鼠模型选择动物的条件: 大鼠骨代谢与人类相似,造模因素比较单一,实验结果相对准确,重复性较好模型与所研究疾病的关系: 该模型能较好地复制骨质疏松的发病过程动物来源及品系: 雌性SD 大鼠,6 月龄,体质量200-300 g,由广州中医药大学实验动物中心提供,实验动物质量合格证明编号:NO.44造模技术描述: 切除大鼠双侧卵巢动物数量及分组方法: 24 只大鼠随机分组:假手术组、病理模型组、淫羊藿苷组、雌二醇组,n=6造模成功评价指标: 病理模型组右侧股骨测量,骨密度值较假手术组明显下降为造模成功造模后实验观察指标: ①骨显微参数;②自噬相关蛋白表达伦理委员会批准: 动物实验方案经广州中医药大学实验动物中心动物实验伦理委员会批准,批准号:2(3)Micro-CT 检测:药物干预12 周后,麻醉后处死所有大鼠,取大鼠右侧股骨置于40 g/L 的多聚甲醛中固定2 d 后更换为体积分数75%的乙醇浸泡,在扫描前1 d 更换为生理盐水浸泡。扫描时,将股骨放在Micro-CT 线圈中,从股骨远端开始进行CT 螺旋扫描,每18 μm 作为一个断层,将所有标本以股骨远端生长板顶点往上除去50 张,再开始往上取100 张去掉皮质为兴趣区域,自带软件分别测定骨密度、骨小梁数量(trabecular number,Tb.N)、骨小梁厚度(trabecular thickness,Tb.Th)、相对骨体积(bone volume/tissue volume,BV/TV)、骨小梁间距(trabecular separation,Tb.Sp)等指标。(4)Western-Blotting:取大鼠的左侧股骨进行检测,余步骤同“1.4.2 中(3) 主要观察指标 ①细胞活力;②ALP 活性;③茜素红染色结果;④凋亡率;⑤MDC 染色结果;⑥成骨分化及自噬相关基因、蛋白的表达;⑦骨骼显微参数 统计学分析 采用SPSS 19.0 软件进行统计学分析,计量数据用±s表示,若数据呈正态分布且方差齐,采用单因素方差分析,进一步多重比较采用LSD 法,P< 0.05 为差异有显著性意义。2 结果 淫羊藿苷的最佳浓度是10-5mmol/L2.1.1 不同浓度淫羊藿苷对细胞活力的影响 与对照组同期比较,24 h 后,10-5,10-6mmol/L 淫羊藿苷组细胞活力增高(P< 0.05);48 h 后,10-4,10-5mmol/L 淫羊藿苷组细胞活力增高(P< 0.05);72 h 后,10-4,10-5,10-6mmol/L 淫羊藿苷组细胞活力增高,提示10-5mmol/L 浓度下的淫羊藿苷更能促进成骨细胞的增殖,见?不同浓度淫羊藿苷对ALP 染色的影响 干预7 d 后,与对照组比较,10-3-10-6mmol/L 淫羊藿苷组ALP 染色深度加强,其中以10-4,10-5mmol/L 更加明显,见?不同浓度淫羊藿苷对ALP 活性的影响 与对照组同期比较,1 d 后,10-5mmol/L 淫羊藿苷组ALP 活性增高(P< 0.05);3 d 后,10-3mmol/L 淫羊藿苷组ALP 活性降低(P< 0.05),10-4,10-5mmol/L 淫羊藿苷组ALP 活性增高(P< 0.05);5 d 后,仅10-5mmol/L 淫羊藿苷组的ALP 活性可见增高(P< 0.05);7 d 后,10-4,10-5mmol/L 淫羊藿苷组ALP 活性增高(P< 0.05),提示10-5mmol/L浓度下的淫羊藿苷更能促进ALP活性,见?不同浓度淫羊藿苷对矿化结节形成的影响 干预21 d后,与对照组比较,10-3-10-6mmol/L 淫羊藿苷组矿化结节的数量可见增多,其中以10-4,10-5mmol/L 淫羊藿苷组更加显著,提示该浓度下的淫羊藿苷更能促进矿化结节的形成,见?不同浓度淫羊藿苷对细胞凋亡的影响 干预48 h 后,对照组的凋亡率为35.3%,10-3mmol/L 淫羊藿苷组的凋亡率为25%,10-4mmol/L 淫羊藿苷组的凋亡率为14.1%,10-5mmol/L 淫羊藿苷组的凋亡率为11.8%,10-6mmol/L 淫羊藿苷组的凋亡率为12.4%,提示10-5mmol/L 淫羊藿苷更能抑制成骨细胞的凋亡,见?不同浓度淫羊藿苷对成骨分化标志物的影响 干预7 d后,与对照组比较,10-4,10-5,10-6mmol/L 淫羊藿苷组OCN、Runx2、Osterix、OPG mRNA 的表达水平增高(P< 0.05);10-3mmol/L 淫羊藿苷组Runx2、OPG mRNA 的表达增高(P<0.05),提示淫羊藿苷能够上调成骨分化标志物的表达且以10-5mmol/L 效应最佳,见?淫羊藿苷通过提高自噬促进成骨细胞分化2.2.1 MDC 检测淫羊藿苷对细胞自噬的影响 采用前面实验所得最佳浓度淫羊藿苷(10-5mmol/L)干预48 h 后,与对照组比较,淫羊藿苷组自噬小体的数量增多;与淫羊藿苷组相比,淫羊藿苷+3-MA 组自噬小体的数量减少,提示淫羊藿苷能够提高细胞的自噬水平,见?淫羊藿苷对成骨分化标志物及自噬相关基因的影响与对照组比较,淫羊藿苷组成骨分化标志物Collagen I、OPN、OCN、Runx2 以及自噬相关基因ULK1、FIP200、ATG13 mRNA的表达增高(P< 0.05);与淫羊藿苷组比较,淫羊藿苷+3-MA组上述指标的表达水平显著降低(P< 0.05),提示淫羊藿苷能够通过提高自噬进而促进成骨细胞的分化活性,见?淫羊藿苷对自噬相关蛋白的影响 与对照组比较,淫羊藿苷组ULK1、FIP200、ATG13 的蛋白表达水平增高(P<0.05);与淫羊藿苷组比较,淫羊藿苷+3-MA 组上述指标的蛋白表达降低(P< 0.05),见?淫羊藿苷通过提高自噬防治骨质疏松2.3.1 淫羊藿苷对去势大鼠骨微结构的影响 与假手术组比较,病理模型组骨密度、相对骨体积、骨小梁数量、骨小梁厚度降低(P< 0.05),骨小梁间距增大(P< 0.05);与病理模型组比较,淫羊藿苷组及戊酸雌二醇组骨密度、相对骨体积、骨小梁数量增高(P< 0.05),骨小梁间距降低(P< 0.05),骨小梁厚度无明显差异(P> 0.05),见?淫羊藿苷对去势大鼠骨组织自噬相关蛋白的影响 与假手术组比较,病理模型组ULK1、FIP200、ATG13 的蛋白表达水平显著降低(P< 0.05);与病理模型组比较,淫羊藿苷组以及戊酸雌二醇组上述指标的蛋白表达增高(P< 0.05),见图11A、B。3 讨论 Discussion随着社会老龄化的加剧,骨质疏松症患病人数逐年增加,其严重并发症“脆性骨折”有较大的致残率和致死率,在很大程度上威胁着人们的生活质量和身心健康[12],如何有效防治骨质疏松成为研究热点之一,研究指出相对于抑制骨吸收,促进骨形成是更加理想的方法[4]。越来越多的基础研究表明中药及其活性成分促进骨形成作用明确,万雷等[13]用补肾健脾活血方含药血清干预过表达骨硬化蛋白重组腺病毒转染的成骨细胞后,发现含药血清能够显著促进成骨细胞的增殖和碱性磷酸酶活性。骨碎补总黄酮是中药骨碎补的有效成分,江丽霞等[14]建立兔桡骨骨缺损模型,在缺损处注入骨碎补总黄酮,发现骨碎补总黄酮能够显著促进缺损处的骨形成。课题组前期的研究亦表明金匮肾气丸、六味地黄丸以及牛膝活性成分蜕皮甾酮具备良好的成骨效能[15-16],此外尚有关于二仙汤、莲心碱、地黄苷等的研究报道[17-19],而与这些研究相比较,淫羊藿苷的研究频率最高[5],但其具体机制至今尚未完全明确。近年来,自噬成为骨代谢研究的热点之一,被报道能够调控成骨细胞的功能等[20-23],课题组推测自噬可能介导了淫羊藿苷的抗骨质疏松效应,因此设计实验,从体内、体外的水平验证上述科研假设。此次研究中,首先对淫羊藿苷的最佳作用浓度进行筛选,根据研究报道,淫羊藿苷的最佳作用浓度区间在10-2-10-6mmol/L[24],陈旭凤等[25]的研究发现淫羊藿苷促进成骨细胞分化的最佳浓度是10-6mmol/L,而WEI 等[26]则发现10-4mmol/L 浓度下的淫羊藿苷最能显著促进骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化。此次研究通过CCK8、ALP 活性检测、茜素红染色实验发现10-5mmol/L 浓度下的淫羊藿苷促进成骨细胞增殖、分化的能力最强;此外,在骨质疏松的发病过程中,成骨细胞的凋亡增加会直接导致骨形成显著减少,因此抑制成骨细胞的凋亡有助于促进骨形成,凋亡检测的结果亦提示10-5mmol/L 淫羊藿苷能够最大程度抑制成骨细胞的凋亡;在成骨分化过程中,成骨分化标志物的表达水平能够反映成骨细胞的活性,RT-qPCR 的结果提示10-5mmol/L 淫羊藿苷更能显著提高成骨分化标志物OCN、Runx2、Osterix、OPG 的表达。综合这些检测结果,表明在此次研究中10-5mmol/L 是淫羊藿苷的最佳作用浓度,这与陈旭凤等[25]、WEI 等[26]的研究结果不同,考虑原因可能与细胞类型及淫羊藿苷来源不同相关。自噬是广泛存在于真核细胞中的生命现象,被认为是细胞的一种自我保护机制,近年来,自噬对成骨细胞的影响越来越受到科研人员的关注。NOLLET 等[27]发现将成骨细胞的自噬相关基因BECN-1、ATG7、LC3 敲除后,其矿化能力显著下降;GAVALI 等[11]发现自噬对人成骨细胞的存活和矿化具有积极的意义,雌激素能够通过提高人成骨细胞的自噬进而促进细胞的存活和矿化能力,而淫羊藿苷具有雌激素样作用[28],因此该研究在确定了淫羊藿苷的最佳作用浓度后,进一步考察其是否通过改变成骨细胞自噬水平而促进成骨细胞分化。MDC 染色能特异性的将细胞内的自噬体染色并发出绿色荧光,染色结果提示淫羊藿苷能促进成骨细胞自噬小体的形成。ULK1/FIP200/ATG13 复合物对自噬体形成有重要的推进作用[29],经RT-qPCR 检测发现淫羊藿苷在增加成骨分化标志物Collagen I、OPN、OCN、Runx2 表达的同时亦上调了ULK1、FIP200、ATG13 的表达水平,而经过3-MA 预处理后,这些指标的表达均明显下调,类似的趋势亦见于Western-Blotting,提示淫羊藿苷促进成骨细胞分化的潜在机制可能与提高自噬相关,这与GAVALI 等[11]的研究结果类似。最后通过去势法构建骨质疏松大鼠模型并通过淫羊藿苷干预,结果提示淫羊藿苷在改善去势大鼠骨显微结构参数的同时上调了大鼠骨组织中ULK1、FIP200、ATG13 的蛋白表达水平,这些结果亦证实了淫羊藿苷可能通过提高自噬而防治骨质疏松。综上,该研究表明淫羊藿苷能够显著促进成骨细胞的增殖以及分化,并且能够改善去势大鼠的骨微结构,潜在机制可能与淫羊藿苷提高细胞自噬相关。值得注意的是,该研究存在一定的局限性:自噬分为起始、延伸、成熟、降解4 个阶段,每个阶段由不同的自噬标志物介导触发,该研究主要探索了淫羊藿苷对自噬“起始阶段”标志物ULK1、FIP200、ATG13 表达的影响,而淫羊藿苷对“延伸、成熟以及降解阶段”存在何种影响尚不明确,在后续研究中应深入阐明。作者贡献:实验设计、实施为姜涛,实验评估为邵敏、陈庆真,资料收集为姜涛。经费支持:该文章接受了“广州市科技计划项目(2)”“国家自然科学基金面上项目()”及“广东省自然科学基金项目(2015A0)”的资助。所有作者声明,经费支持没有影响文章观点和对研究数据客观结果的统计分析及其报道。利益冲突:文章的全部作者声明,在课题研究和文章撰写过程中不存在利益冲突。机构伦理问题:实验方案经广州中医药大学实验动物中心动物实验伦理委员会批准,批准号为2。实验过程遵循了国际兽医学编辑协会《关于动物伦理与福利的作者指南共识》和本地及国家法规。写作指南:该研究遵守国际医学期刊编辑委员会《学术研究实验与报告和医学期刊编辑与发表的推荐规范》。文章查重:文章出版前已经过专业反剽窃文献检测系统进行3次查重。文章外审:文章经小同行外审专家双盲外审,同行评议认为文章符合期刊发稿宗旨。生物统计学声明:文章统计学方法已经通过广州中医药大学基础医学院统计学专家审核。文章版权:文章出版前杂志已与全体作者授权人签署了版权相关协议。开放获取声明:这是一篇开放获取文章,根据《知识共享许可协议》“署名-非商业性使用-相同方式共享4.0”条款,在合理引用的情况下,允许他人以非商业性目的基于原文内容编辑、调整和扩展,同时允许任何用户阅读、下载、拷贝、传递、打印、检索、超级链接该文献,并为之建立索引,用作软件的输入数据或其它任何合法用途。图1 |CCK8 检测不同浓度淫羊藿苷对MC3T3-E1 细胞增殖的影响Figure 1 |The proliferation of MC3T3-E1 cells intervened by different concentrations of icariin in cell counting kit-8 test图注:与对照组同期比较,aP< 0.05图2 |各组成骨细胞碱性磷酸酶染色结果Figure 2 |Alkaline phosphatase staining of osteoblasts in each group图注:A-E 分别为对照组,10-3,10-4,10-5及10-6mmol/L 淫羊藿苷组。1 为大体观察,2为×50 图片图3 |各组成骨细胞碱性磷酸酶活性结果Figure 3 |Alkaline phosphatase activity of osteoblasts in each group图注:与对照组同期比较,aP< 0.05图4 |各组成骨细胞茜素红染色结果Figure 4 |Alizarin red staining of osteoblasts in each group图注:A-E分别为对照组,10-3,10-4,10-5及10-6mmol/L 淫羊藿苷组。1 为大体观察,2为×50 图片图5 |各组成骨细胞凋亡率Figure 5 |Apoptosis rate of osteoblasts in each group图注:A-E 分别为对照组,10-3,10-4,10-5及10-6mmol/L 淫羊藿苷组图6 |不同浓度淫羊藿苷对成骨分化标志物的影响Figure 6 |The effect of different concentrations of icariin on osteogenic differentiation markers图注:与对照组同期比较,aP< 0.05图7 |淫羊藿苷对细胞自噬的影响(MDC 染色,标尺100 μm)Figure 7|The effect of icariin on autophagy (MDC staining, scale bar=100 μm)图注:A、B、C 分别为对照组,淫羊藿苷组,淫羊藿苷+3MA 组图8 |淫羊藿苷对成骨分化标志物以及自噬的影响Figure 8|The effect of icariin on autophagy and osteogenic differentiation markers图注:与对照组同期比较,aP< 0.05;与淫羊藿苷组比较,bP< 0.05图9 |淫羊藿苷对自噬相关蛋白的影响Figure 9 |The effect of icariin on autophagy-related proteins图注:A 为蛋白条带图,1-3 分别代表对照组,淫羊藿苷组,淫羊藿苷+3-MA 组;B 为蛋白表达柱状图,与对照组比较,aP< 0.05,与淫羊藿苷组比较,bP< 0.05图10 |淫羊藿苷对骨微结构参数的影响Figure 10 |The effect of icariin on bone microstructure parameters图注:与假手术组比较,aP< 0.05;与病理模型组比较,bP< 0.05图11 |淫羊藿苷对ULK1、FIP200、ATG13 蛋白表达的影响Figure 11 |The effect of icariin on the protein expression of ULK1, FIP200,and ATG13图注:A 为蛋白条带图,1-4 分别代表假手术组,病理模型组,淫羊藿苷组,戊酸雌二醇组;B 为蛋白表达柱状图,与假手术组比较,aP< 0.05;与病理模型组比较,bP< 0.054 参考文献 References[1] 中华医学会骨质疏松和骨矿盐疾病分会. 原发性骨质疏松症诊疗指南(2017)[J].中华骨质疏松和骨矿盐疾病杂志,2017,20(5):413-443.[2] YAVROPOULOU MP, PAPAPOULOS SE. 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文章来源:《中国实验方剂学杂志》 网址: http://www.zgsyfjxzzzz.cn/qikandaodu/2021/0128/402.html