期刊信息
主办:中国中医科学院中药研究所;中华中医药学会
主管:国家中医药管理局
ISSN:1005-9903
CN:11-3495/R
语言:中文
周期:半月
影响因子:1.817375
数据库收录:
北大核心期刊(2008版);北大核心期刊(2011版);北大核心期刊(2014版);北大核心期刊(2017版);化学文摘(网络版);中国科学引文数据库(2015-2016);中国科学引文数据库(2017-2018);中国科学引文数据库(2019-2020);日本科学技术振兴机构数据库;中国科技核心期刊;期刊分类:中药学
期刊热词:
药理
淫羊藿苷通过提高自噬促进成骨细胞分化防治骨(2)
【作者】网站采编
【关键词】
【摘要】(3)ALP 活性检测:消化第3 代细胞,以5×104个/孔的密度接种于24 孔板,细胞分组以及培养方法同“CCK8 检测细胞增殖”,于干预1,3,5,7 d 后弃去培养液,
(3)ALP 活性检测:消化第3 代细胞,以5×104个/孔的密度接种于24 孔板,细胞分组以及培养方法同“CCK8 检测细胞增殖”,于干预1,3,5,7 d 后弃去培养液,用裂解液裂解细胞后按照ALP 活性试剂盒的说明进行操作,计算金氏单位(U/mg)用以反映ALP 活性。
(4)茜素红染色:消化第3 代细胞,以1×104个/孔的密度接种于24 孔板,细胞分组以及培养方法同“CCK8 检测细胞增殖”,培养21 d 后弃去培养液,用PBS 清洗3 遍,每次5 min,使用40 g/L的多聚甲醛固定30 min后弃去多聚甲醛,PBS 清洗3 遍,每孔加入300 μL(覆盖细胞)茜素红染色液,室温下染色10 min,PBS 清洗3 遍,扫描以及显微镜拍照。
(5)ANNEXIN V-FITC/PI 凋亡检测:消化第3 代细胞,以1×104个/孔的密度接种于24 孔板,细胞分组以及培养方法同“CCK8 检测细胞增殖”,干预48 h 后,按照试剂盒说明进行操作。
(6)实时荧光定量聚合酶链反应(RT-qPCR)检测:取第4代细胞,调整细胞密度至3×104个/cm2,每孔0.5 mL 接种于6 孔板中,补齐培养基至2 mL,然后置于37 ℃,体积分数5%CO2的培养箱中培养,细胞分组以及培养方法同上;24 h 后弃培养基,加入不同浓度的淫羊藿苷直至2 mL/孔,培养7 d,弃去培养液,用RNA 提取试剂盒提取总RNA,紫外分光光度计测定RNA 纯度,每组取1.0 μg 总RNA,分别加入反转录试剂盒的反应体系,在反转录仪中进行反转录生成cDNA 后,采用RT-qPCR 测定Runx2、Osterix、OCN、OPG 的表达情况,采用2-ΔΔCt法并以β-actin 为内参计算上述指标的相对表达量,用于统计学分析,引物序列见表1。
表1 |引物序列Table 1 |Primer sequences of RT-qPCR基因名称 引物序列 产物长度Runx2 Forward:TGG CTT GGG TTTC AGG TTA G 104 bp Reverse:GGT TTC TTA GGG TCT TGG AGT G Osterix Forward:TGG AGA GGG AAA GGG ATT CT 97 bp Reverse:GAA ATC TAC GAG CAA GGT CTC C OCN Forward:AGT GAG GGT TAA GCA GGA ATA C 101 bp Reverse:CAG ACT AAG CTA AGA GCC CAA A OPG Forward:GCC GAG AGT GTA GAG AGG ATA A 105 bp Reverse:CTT CAC CAT TTC CTG GTC TCT G Collagen I Forward:AGA CCT GTG TGT TCC CTA CT 110 bp Reverse:GAA TCC ATC GGT CAT GCT CTC OPN Forward:AGT GAG GGT TAA GCA GGA ATA C 101 bp Reverse:CAG ACT AAG CTA AGA GCC CAA A ULK1 Forward:CAG GGT GGA CAC ATG CTA ATA C 104 bp Reverse:CAG CTT GTG GAC ACT CAG ATA C FIP200 Forward:CAG CAA GAG CGG GAT AAA GA 111 bp Reverse:ACT GCT AGT GCG GAG TTT AC ATG13 Forward:TCC ACC AGG CAA TTT GAG AG 89 bp Reverse:ATA GGA GAA GAG CTG GGA TAG G β-actin Forward:GAG GTA TCC TGA CCC TGA AGT A 104 bp Reverse:CAC ACG CAG CTC ATT GTA GA
1.4.2 淫羊藿苷通过自噬促进成骨细胞分化的研究 消化第4代MC3T3-E1 细胞,将细胞分为3 组:对照组、淫羊藿苷组、淫羊藿苷+3-MA 组,后2 组用前面实验得出的最佳浓度淫羊藿苷处理细胞,淫羊藿苷+3-MA 组在此基础上加10 mmol/L自噬抑制剂3-MA ,进行以下测试:
(1)MDC 染色:消化第4 代细胞,以3×103个/孔的密度接种于96 孔板,细胞同上分3 组,每组6 个复孔,待细胞贴壁后弃去培养基,加入含药或不含药的新鲜成骨诱导培养基,培养48 h;按照MDC Stain(×500):Stain buffer=1 ∶499的比例配制成MDC 染色工作液,每孔加入100 μL 的MDC 染色工作液,37 ℃,体积分数5%CO2避光孵育60 min,弃去工作液,加入Wash buffer 清洗3 遍,荧光显微镜下观察(激发滤光片波长355 nm,阻断滤光片波长512 nm)。
(2)RT-qPCR:细胞分组以及培养方法同“MDC 染色”,余步骤同“1.4.1 中(6)”,检测指标为Runx2、OCN、Collagen I、OPN、ULK1、FIP200、ATG13,引物序列见表1。
(3)免疫印迹(Western-Blotting):收集第4 代细胞,制成细胞浓度为1×108L-1的细胞混悬液,加2 mL 到6 孔板中,细胞分组以及培养方法同“MDC 染色”,置37 ℃,体积分数5%CO2培养过夜,7 d 后分别提取各组细胞总蛋白,12 000 r/min离心15 min,取上清100 μL,蛋白定量,配制样品,通过上样、电泳、转膜、封闭、孵育一抗二抗后显影,测出相应灰度值进行分析。
1.4.3 动物实验
(1)动物分组方法:SD 大鼠24 只分为4 组,假手术组、病理模型组、淫羊藿苷组、戊酸雌二醇组,每组6 只。打开Excel,利用升序排序,首先将所有SD 大鼠按体质量由小到大编号,利用Excel 生成24 个两位整数的随机数,将所得的两位随机数除以4,余数为0 放在假手术组,余数为1 的放在病理模型组,余数为2 的放在淫羊藿苷组,余数为3 的放在戊酸雌二醇组,如果余数为0 的那一组动物数已经达到6只,则将下次余数为0 的动物分配至第二组,其他同理,按照这种分组方法,一般情况下,得到的各组动物在体质量方面均无差异。
(2)造模及给药:采取双侧卵巢切除术构建动物模型,具体步骤同前期研究[15];术后连续3 d 肌注青霉素钠,然后开始给药进行干预;淫羊藿苷溶解在0.5%的羧甲基纤维素钠中,戊酸雌二醇以生理盐水直接溶解;淫羊藿苷以200 mg/(kg·d)的剂量进行灌胃,戊酸雌二醇以0.1 mg/(kg·d)剂量灌胃,假手术组和病理模型组予以等量生理盐水灌胃,疗程为12 周。
文章来源:《中国实验方剂学杂志》 网址: http://www.zgsyfjxzzzz.cn/qikandaodu/2021/0128/402.html