期刊信息
主办:中国中医科学院中药研究所;中华中医药学会
主管:国家中医药管理局
ISSN:1005-9903
CN:11-3495/R
语言:中文
周期:半月
影响因子:1.817375
数据库收录:
北大核心期刊(2008版);北大核心期刊(2011版);北大核心期刊(2014版);北大核心期刊(2017版);化学文摘(网络版);中国科学引文数据库(2015-2016);中国科学引文数据库(2017-2018);中国科学引文数据库(2019-2020);日本科学技术振兴机构数据库;中国科技核心期刊;期刊分类:中药学
期刊热词:
药理
通络止痛凝胶干预膝关节骨性关节炎模型兔的软(6)
【作者】网站采编
【关键词】
【摘要】[29] 王欢,王庆甫,唐学章,等.白芍总苷对滑膜成纤维细胞增殖、凋亡及周期影响的实验研究[J].天津中医药,2017,34(12): 841-844. [30] 祁印泽.新型通络止痛方凝胶制
[29] 王欢,王庆甫,唐学章,等.白芍总苷对滑膜成纤维细胞增殖、凋亡及周期影响的实验研究[J].天津中医药,2017,34(12): 841-844.
[30] 祁印泽.新型通络止痛方凝胶制剂研究及其治疗膝骨关节病的临床观察[D].北京:北京中医药大学,2018.
[31] 张晓哲,张栋,马玉峰,等.通络止痛凝胶制剂对膝骨关节炎大鼠的影响[J].中华中医药杂志,2019,34(5):2184-2188.
0 引言 Introduction膝关节骨性关节炎(knee osteoarthritis,KOA)是最常见的骨骼肌退行性疾病之一,伴有持续疼痛和功能障碍,滑膜炎症、关节软骨的进行性退变是其主要的病理特征[1-4]。有研究指出KOA 是导致下肢残疾的十大病因之一[3]。尽管目前KOA 的发病机制尚不清楚,但炎症一直被认为是KOA 病程中的重要环节[3,5-7]。已有研究提示软骨损伤可引起滑膜炎症,软骨细胞介导的炎症反应在骨关节炎的发生发展中起关键作用[7]。因此,有效抑制软骨细胞炎症可能在延缓甚至逆转骨关节炎的进展中发挥作用。通络止痛凝胶是在现代药物提取技术的基础上将通络止痛方制备成凝胶制剂,直接用于患处,方便患者使用。既往研究表明通络止痛方可以有效抑制滑膜炎症、改善患者症状[8-10],然而通络止痛凝胶对软骨炎症及退变改善情况以及何种程度的KOA 更适用于通络止痛凝胶治疗,目前仍不清楚。因此该研究拟通过动物实验论证通络止痛凝胶对于KOA软骨炎症及退变的影响以及初步探讨何种程度的KOA 更适用于通络止痛凝胶治疗。1 材料和方法 Materials and 设计 随机对照动物实验 时间及地点 实验于2019 年5 至12 月在中国中医科学院中药研究所完成 材料1.3.1 实验动物与分组 所有家兔均饲养于中国中医科学院医学动物实验中心,该研究严格按照《实验动物护理和使用指南》福利伦理执行,并得到中国中医科学院动物护理和使用委员会批准。选取雄性6 月龄家兔56 只,体质量(2.) kg,均由北京科宇动物养殖中心提供,合格证号:SCXK(京)2018-0010,适应性喂养1 周后使用随机数字表法将家兔随机等分为8 组,每组7 只,即空白对照组、假手术组、轻度KOA 模型组、中度KOA 模型组、重度KOA 模型组、通络止痛凝胶干预轻度KOA 组、通络止痛凝胶干预中度KOA组、通络止痛凝胶干预重度KOA 组,所有家兔均用同样饲养条件喂养 实验主要药物、试剂 通络止痛凝胶按规定配方比例及流程(专利号:2.8)制作而成,主要成分为卡波姆基质940(上海源叶生物科技有限公司)、浓煎中药液(桂枝、白芍、桃仁、制草乌、牛膝等)、桂皮醛脂质体混悬液(由桂皮醛、卵磷脂、胆固醇等按配方比例制成)和乳香、没药细粉。水合氯醛(北京拜尔迪生物科技有限公司);BCA 蛋白浓度测定试剂盒(美国Thermo Scientific 公司);qPCR 所需试剂(南京诺唯赞生物科技有限公司);兔白细胞介素1β、肿瘤坏死因子α、基质金属蛋白酶13 以及解聚蛋白样金属蛋白酶5 一抗(美国CST 公司);β-Actin、二抗及荧光显影液(美国Proteintech 公司) 实验方法1.4.1 家兔造模与干预 空白对照组不予以任何处理;假手术组在切开关节囊后立即予以缝合,以排除手术影响,随后不予以处理;其余各组均予以改良Hulth 法[11]进行造模,切断右膝内侧副韧带、前交叉韧带及切除内侧半月板,确定关节不稳后逐层缝合并予以连续3 d 肌肉注射青霉素8×105U防止感染,术后1 周所有动物每日驱赶30 min。根据文献报道,以造模后4,8,16 周为轻、中、重度KOA 模型时间节点[12];空白对照组和假手术组在11 周时处死,轻、中、重度KOA 模型组分别于造模后4,8,16 周时处死,通络止痛凝胶干预轻、中、重度KOA 组分别在造模4,8,16 周予以通络止痛凝胶外敷治疗3 周,每周3 次(周一、周三及周六),最后一次给药后2 d 处死。通络止痛凝胶外敷治疗量根据人与动物体表面积换算公式计算得出,每次约为1 mL 凝胶。组织工程实验动物造模过程的相关问题造模目的 制备不同程度的膝关节骨性关节炎家兔模型选择动物的基本资料雄性家兔56 只,体质量(2.) kg,随机分为8 组,空白对照组、假手术组,轻、中、重度膝关节骨性关节炎模型组,通络止痛凝胶干预轻、中、重度膝关节骨性关节炎组,每组7 只模型与所研究疾病的关系手术诱发性动物模型造模技术描述 切断右膝内侧副韧带、前交叉韧带及切除内侧半月板造模成功评价指标造模后关节不稳,苏木精-伊红染色显示软骨退变观察指标 测量右膝关节直径、苏木精-伊红染色观察软骨形态学变化,RT-qPCR 和Western blot 检测软骨组织中白细胞介素1β、肿瘤坏死因子α、基质金属蛋白酶13 及解聚蛋白样金属蛋白酶5 的mRNA 水平伦理委员会批准实验方案经中国中医科学院动物护理和使用伦理委员会批准,批准号为1.4.2 样本收集与保存 用10%水合氯醛按2 mL/kg 的量对家兔进行耳缘静脉注射麻醉,测量右膝关节直径变化并记录,然后逐层暴露膝关节,取出膝关节股骨末端,1 份置于体积分数为10%甲醛溶液中常温保存进行固定,随后进行包埋、切片及苏木精-伊红染色,观察软骨组织损伤情况;1 份用于RT-qPCR、western blot 检测软骨组织中白细胞介素1β、肿瘤坏死因子α、基质金属蛋白酶13 及解聚蛋白样金属蛋白酶5 的表达 主要观察指标1.5.1 家兔右膝关节直径变化及软骨损伤情况 各组家兔均在造模前以及造模后相应时间点以及干预3 周后使用游标卡尺测量右膝关节直径长度,观察患膝关节肿胀程度变化。制备软骨组织病理切片,进行苏木精-伊红染色,置于光镜下观察软骨组织损伤情况 RT-qPCR 检测软骨组织中白细胞介素1β、肿瘤坏死因子α、基质金属蛋白酶13 及解聚蛋白样金属蛋白酶5 的mRNA 水平变化 各组均取10 mg 软骨组织,使用Trizol 法提取软骨组织中的mRNA,采用分光光度仪检测各组mRNA 浓度。根据反转录试剂盒说明书将mRNA 反转录为cDNA,加入目标基因的上下游引物及mix 荧光染料后上机检测各组白细胞介素1β、肿瘤坏死因子α、基质金属蛋白酶13 及解聚蛋白样金属蛋白酶5 的mRNA 表达水平。引物见表1。表1 |实验所需引物列表Table 1 |List of primers required for the study基因名称 引物序列 碱基数白细胞介素1β 上游:CCG TGG ACC TTC CAG GAT GA 上游:20 bp下游:GGG AAC GTC ACA CAC CAG CA 下游:20 bp肿瘤坏死因子α 上游:CAT CTT CTC AAA ATT CGA GTG ACA A 上游:25 bp下游:TGG GAG TAG ACA AGG TAC AAC CC 下游:23 bp基质金属蛋白酶13 上游:TGC AGA GAG CTA CCT GAG AT 上游:20 bp下游:ACT GCA TTT CTC GGA GCC TG 下游:20 bp解聚蛋白样金属蛋白酶5 上游:TGG GCT ACT CAG CCA CAA AG 上游:20 bp下游:CCA CTG CAG CTG TGA CGT AT 下游:20 bp β-Actin 上游:GCA TCC CCA AAG TCC CCA AA 上游:20 bp下游:GTC ACA TGG CAT CTC ACG AT 下游:20 bp1.5.3 Western blot 检测软骨组织中白细胞介素1β、肿瘤坏死因子α、基质金属蛋白酶13 及解聚蛋白样金属蛋白酶5的蛋白水平变化 取10 mg 软骨组织,剪碎后加入200 μL的RIPA 和PMSF 混合液,使用匀浆机匀浆后于4 ℃下静置20 min,12 000 r/min 离 心15 min,取180 μL 上 清 并 进 行BCA 蛋白浓度测定,随后加入PBS 使各组蛋白浓度一致,再加入1/4 体积的上样缓冲液,混匀后于95 ℃金属浴5 min,放于-80 ℃保存。根据目标分子质量大小配置浓度为8%-12%的分离胶,每组加入10 μL 样品进行电泳,随后进行电转将蛋白转至PVDF 膜,5%脱脂奶粉封闭1 h 后加入适当浓度白细胞介素1β、肿瘤坏死因子α、基质金属蛋白酶13 以及解聚蛋白样金属蛋白酶5 一抗4 ℃孵育过夜,TBST 清洗后加入相应二抗,室温孵育1 h 后加入ECL 显?统计学分析 所有数据均采用±s表示,使用SPSS 22.0软件进行统计分析。组间比较时先进行正态分布检验,再进行方差齐性检验。符合正态分布且方差齐性使用非配对t检验;符合正态分布但不符合方差齐性使用welch’s 校正非配对t检验;非正态分布使用Mann-Whitney 秩和检验,P< 0.05为差异有显著性意义。2 结果 家兔一般情况 在实验中,中度KOA 模型组和通络止痛凝胶干预重度KOA 组各有1 只家兔因麻醉过量死亡,假手术组和通络止痛凝胶干预轻度KOA 组在日常喂养中因消化道不良反应死亡1 只,其余家兔未见明显异常。各组家兔在术后均未出现感染,皮肤愈合良好,通络止痛凝胶干预轻、中、重度KOA 组在予以通络止痛凝胶外敷时,均未见有皮肤红肿等不良反?家兔右膝关节直径变化 与造模前相比,改良Hulth 法造模家兔在4 周后右膝关节直径显著增加,差异有显著性意义(P< 0.05);8 周和16 周关节直径继续增大,与造模前比差距更为显著(P< 0.01)。在予以通络止痛凝胶外用治疗3 周后,通络止痛凝胶干预轻、中度KOA 组右膝关节直径显著降低(P< 0.01),通络止痛凝胶干预重度KOA 组直径亦明显降低(P< 0.05),但没有其他2 组显著,见表2。表2 |各组家兔不同时间点下右膝关节直径变化 (±s,mm)Table 2 |Changes of right knee joint diameter in rabbits at different time points表注:与造模前相比,aP< 0.05,bP< 0.01;与造模4 周或8 周或16 周后相比,cP<0.05,dP< 0.01。KOA:膝关节骨性关节炎组别 n 造模前 4 周 8 周 16 周 干预3 周后空白对照组 7 18. 18. 18. - -假手术组 6 18. 18. 19. - -轻度KOA 模型组7 18. 19. - - -中度KOA 模型组6 18. - 20. - -重度KOA 模型组7 18. - - 22. -通络止痛凝胶干预轻度KOA 组6 18. 19. - - 19.通络止痛凝胶干预中度KOA 组7 18. - 20. - 19.通络止痛凝胶干预重度KOA 组6 18. - - 22. 21. 各组家兔软骨损伤情况 正常软骨组织结构完整,各层排列整齐,软骨面平整、光滑,软骨基质着色均一,潮线清晰,未见软骨细胞簇集,无血管翳生成,见图1A;假手术组与空白对照组未见明显区别,软骨面完整,见图1B;轻、中及重度KOA 模型组软骨组织均可见不同程度软骨损伤,随造模时间延长而逐渐加重,轻度KOA 模型组软骨表面粗糙,细胞排列紊乱,可见部分软骨细胞簇集,见图1C;中度KOA模型组软骨表层和移行层出现分层,软骨细胞簇集增多,血管翳增生,见图1D;重度KOA 模型组软骨损伤进一步加重,出现大量剥脱,软骨陷凹形成,见图1E。通络止痛凝胶干预轻、中度KOA 模型组均有明显减轻,软骨较平整,通络止痛凝胶干预中度KOA 组仍可见部分软骨细胞簇集,见图1F,G;通络止痛凝胶干预重度KOA 模型组软骨损伤减轻,剥脱减少,但仍可见软骨出现分层及大量细胞簇集,见?各组家兔软骨组织白细胞介素1β、肿瘤坏死因子α、基质金属蛋白酶13 及解聚蛋白样金属蛋白酶5 的mRNA 水平如图2 所示,假手术组与空白对照组在白细胞介素1β、肿瘤坏死因子α、基质金属蛋白酶13 及解聚蛋白样金属蛋白酶5的mRNA 水平变化上无明显区别,而轻、中、重度KOA 模型组白细胞介素1β、肿瘤坏死因子α 的mRNA 表达明显升高,差异有显著性意义(P< 0.01),且随时间延长而逐渐升高;而基质金属蛋白酶13 及解聚蛋白样金属蛋白酶5 的mRNA 表达在轻、中、重度KOA 模型组虽有显著增加,但在中度和重度组间无显著差别,提示造模成功。通络止痛凝胶干预轻、中、重度KOA 组软骨组织中白细胞介素1β、肿瘤坏死因子α、基质金属蛋白酶13 及解聚蛋白样金属蛋白酶5 的mRNA 表达显著下降(P< 0.01,P< 0.05),尤其是通络止痛凝胶干预轻、中度KOA 组 各组家兔软骨组织中白细胞介素1β、肿瘤坏死因子α、基质金属蛋白酶13 及解聚蛋白样金属蛋白酶5 的蛋白水平如图3 所示,各造模组软骨组织中白细胞介素1β、肿瘤坏死因子α、基质金属蛋白酶13 及解聚蛋白样金属蛋白酶5的表达均显著高于空白对照组及假手术组(P< 0.01)。通络止痛凝胶干预轻、中度KOA 组软骨组织中白细胞介素1β、肿瘤坏死因子α、基质金属蛋白酶13 及解聚蛋白样金属蛋白酶5 的蛋白表达显著降低(P< 0.01,P< 0.05);而通络止痛凝胶干预重度KOA 家兔软骨组织中白细胞介素1β、肿瘤坏死因子α 及解聚蛋白样金属蛋白酶5 亦有明显降低(P< 0.05),但较轻、中度组变化较小,通络止痛凝胶干预重度KOA 组基质金属蛋白酶13 表达虽有降低,但差异无显著性意义(P>0.05)。3 讨论 Discussion全膝关节置换术一直被认为是治疗终末期KOA 的最佳疗法[13],但其仍存在创伤大、花费高等缺点,且有术后感染、翻修以及疗效不满意等并发症风险[14-16]。因此有效延缓甚至逆转软骨退变,避免早、中期KOA 过早进展成晚期KOA 一直是骨科医师关注的重点,尤其是对于中青年KOA 患者。炎症细胞因子在KOA 的发病过程中起重要作用,尤其是白细胞介素1β,被认为在骨性关节炎的病理发展中起着关键作用[17]。白细胞介素1β 可以显著刺激一氧化氮、诱导型一氧化氮合酶和前列腺素E2 等炎性细胞因子的产生,这些因子均与骨性关节炎进展有关[18-19];此外,白细胞介素1β 还可以通过激活基质金属蛋白酶和解聚蛋白样金属蛋白酶的表达,引起软骨细胞外基质和胶原蛋白的丢失,进而引起软骨损伤[17]。肿瘤坏死因子α 是导致骨性关节炎发病的另一种炎性细胞因子,其可以通过肿瘤坏死因子受体结合诱导环氧化酶Ⅱ产生,进而促进滑膜细胞产生前列腺素E2,诱导滑膜炎症; 肿瘤坏死因子α 还可以促进滑膜成纤维细胞产生基质金属蛋白酶,诱导软骨破坏;此外肿瘤坏死因子α 还可以通过与肿瘤坏死因子受体结合,激活IκB 激酶,使NF-κB 与IκB 形成的二聚体解聚,激活NF-κB 信号通路,引发下游级联反应[20]。基质金属蛋白酶13 是一种基质金属蛋白酶家族成员,可基于保守的机制裂解蛋白质底物、促进软骨周转和分解、降解细胞外基质成分,在软骨损伤过程中起重要的病理作用[21-22]。解聚蛋白样金属蛋白酶主要有由具有血小板反应蛋白基序的锌金属蛋白酶组成,是降解聚蛋白多糖的另一个重要家族[23-24],解聚蛋白样金属蛋白酶5 是解聚蛋白样金属蛋白酶家族的主要成员。聚蛋白多糖是软骨细胞外基质的主要成分之一,其能保护胶原蛋白不被降解。因此该实验通过观察软骨组织中白细胞介素1β、肿瘤坏死因子α、基质金属蛋白酶13 及解聚蛋白样金属蛋白酶5 表达变化推测各组软骨损伤的情况。图 1 |苏木精-伊红染色显示各组软骨损伤情况(×200)Figure 1 |Hematoxylin-eosin staining of cartilage damage in each group (×200)图注:A,B 为空白对照组及假手术组;C-E 为轻、中、重度KOA 模型组,软骨组织均可见不同程度软骨损伤,随造模时间延长而逐渐加重;F-H 为通络止痛凝胶干预轻、中、重度KOA 组,软骨损伤均有减轻,但通络止痛凝胶干预中度KOA 组仍可见部分软骨细胞簇集,通络止痛凝胶干预重度KOA 模型组仍可见软骨出现分层及大量细胞簇集。KOA:膝关节骨性关节炎图 2 |RT-qPCR 检测软骨组织中白细胞介素1β、肿瘤坏死因子α、基质金属蛋白酶13 及解聚蛋白样金属蛋白酶5 的mRNA 水平变化Figure 2 |RT-qPCR detection of the mRNA levels of interleukin-1β, tumor necrosis factor-α, matrix metalloproteinase-13 and disintegrin-like metalloproteinase with thrombospondin motifs-5 in cartilage tissue图注:A,B 为空白对照组及假手术组;C-E 为轻、中、重度KOA 模型组;F-H 为通络止痛凝胶干预轻、中、重度KOA 组。各模型组与空白对照组比较,aP< 0.01;各通络止痛凝胶干预组与各模型组比较,bP< 0.01,cP< 0.05。KOA:膝关节骨性关节炎图 3 |Western blot 检测软骨组织中白细胞介素1β、肿瘤坏死因子α、基质金属蛋白酶13 及解聚蛋白样金属蛋白酶5 的蛋白水平变化Figure 3 |Western blot detection of the protein levels of interleukin-1β, tumor necrosis factor-α,matrix metalloproteinase-13 and disintegrin-like metalloproteinase with thrombospondin motifs-5 in cartilage tissue图注:A,B 为空白对照组及假手术组;C-E 为轻、中、重度KOA 模型组;F-H 为通络止痛凝胶干预轻、中、重度KOA 组;各模型组与空白对照组比较,aP< 0.01;各通络止痛凝胶干预组与各模型组比较,bP< 0.05。KOA:膝关节骨性关节炎通络止痛方主要含桂枝、白芍、桃仁、红花、乳香、没药、牛膝等药物,是作者导师治疗KOA 的经验方。在北京市中医药管理局和国自然的资助下,对通络止痛方治疗KOA 的疗效与机制进行了多方面的验证。在临床应用上,作者发现超声促透通络止痛方治疗4 周和8 周后均可以显著促进患者目测类比疼痛评分和膝关节功能评分,改善患者症状[8];在动物层面上,作者观察了超声促透通络止痛凝胶对于关节液和滑膜中炎性因子环氧化酶Ⅱ、基质金属蛋白酶3 等炎性因子表达变化,发现其可有效抑制炎性因子的表达,组织形态学观察也显示滑膜炎性程度和软骨退变程度均有明显减轻[25-26];在细胞层面上,作者观察了通络止痛方君药有效成分——桂皮醛、白芍总苷对滑膜成纤维细胞周期、增殖和凋亡的影响,发现桂皮醛和白芍总苷可以有效延长G1期、缩短S 期,抑制细胞增殖并促进其凋亡[27-29];此外桂皮醛、白芍总苷还可以显著抑制脂多糖诱导后滑膜成纤维细胞中Toll 样受体4、Toll 样受体2、白细胞介素1β 及基质金属蛋白酶13 的表达,推测通络止痛方可能是通过调控固有免疫应答进程进而抑制滑膜炎性,达到治疗KOA 的疗效[9]。通络止痛凝胶是在通络止痛方的基础上,通过卡波姆、明胶等具有良好生物相容性的化合物作为载体制备而成的,方便了患者的携带与使用,并已成功申请专利。临床试验表明外敷通络止痛凝胶可以有效提高KOA患者功能评分,改善膝关节主动屈曲互动度[由治疗前的(71.) °提升至(86.)°]及髌骨被动左右活动度[由治疗前的(5.) mm 提升至(9.) mm][30];动物实验也证明其能有效改善KOA 大鼠滑膜组织中白细胞介素1β、肿瘤坏死因子α 及基质金属蛋白酶13 的表达量[31]。该实验首次在动物层面验证通络止痛凝胶对KOA 病程中软骨炎症和损伤的影响并探讨了何种程度的KOA 更适用于通络止痛凝胶外敷治疗。结果显示,予以改良Hulth 法造模后,模型组家兔右膝直径较正常组显著增加,且随造模时间延长而逐渐加大(P< 0.05,P<0.01);予以通络止痛凝胶外用治疗后,各组KOA 家兔右膝直径均有下降,差异有显著性意义(P< 0.05,P< 0.01),但在重度KOA 组差异明显较低。形态学结果显示通络止痛凝胶治疗后软骨损伤情况明显好转,但重度KOA 组仍可见软骨出现分层。Western blot 和RT-qPCR结果显示,通路止痛凝胶可以降低KOA 家兔软骨组织中白细胞介素1β、肿瘤坏死因子α、基质金属蛋白酶13 及解聚蛋白样金属蛋白酶5 表达,尤其是在轻、中度KOA 组。综上所述,通络止痛凝胶可以显著抑制KOA 家兔软骨组织炎症,延缓软骨退变,尤适用于轻、中度KOA 模型,是一种治疗KOA 的有效疗法。致谢:感谢北京中医药大学第三附属医院祁印泽师兄的支持与帮助。作者贡献:实验设计为陈谱、王庆普,实验实施为陈谱、阮安民、周俊、张晓哲,实验评估为陈谱、阮安民、宗晨钟,资料收集为陈谱、周俊。经费支持:该文章接受了“国家自然科学基金面上项目()”及“北京中医药大学自主课题项目(2019-JYB-XS-232)”的资助。所有作者声明,经费支持没有影响文章观点和对研究数据客观结果的统计分析及其报道。利益冲突:文章的全部作者声明,在课题研究和文章撰写过程中不存在利益冲突。机构伦理问题:实验方案经中国中医科学院动物护理和使用伦理委员会批准,批准号为。实验过程遵循了国际兽医学编辑协会《关于动物伦理与福利的作者指南共识》和本地及国家法规。写作指南:该研究遵守国际医学期刊编辑委员会《学术研究实验与报告和医学期刊编辑与发表的推荐规范》。文章查重:文章出版前已经过专业反剽窃文献检测系统进行3 次查重。文章外审:文章经小同行外审专家双盲外审,同行评议认为文章符合期刊发稿宗旨。生物统计学声明:文章统计学方法已经通过北京中医药大学生物统计学专家审核。文章版权:文章出版前杂志已与全体作者授权人签署了版权相关协议。开放获取声明:这是一篇开放获取文章,根据《知识共享许可协议》“署名-非商业性使用-相同方式共享4.0”条款,在合理引用的情况下,允许他人以非商业性目的基于原文内容编辑、调整和扩展,同时允许任何用户阅读、下载、拷贝、传递、打印、检索、超级链接该文献,并为之建立索引,用作软件的输入数据或其它任何合法用途。4 参考文献 References[1] HUNTER DJ, BIERMA-ZEINSTRA S. 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文章来源:《中国实验方剂学杂志》 网址: http://www.zgsyfjxzzzz.cn/qikandaodu/2021/0128/404.html