期刊信息
主办:中国中医科学院中药研究所;中华中医药学会
主管:国家中医药管理局
ISSN:1005-9903
CN:11-3495/R
语言:中文
周期:半月
影响因子:1.817375
数据库收录:
北大核心期刊(2008版);北大核心期刊(2011版);北大核心期刊(2014版);北大核心期刊(2017版);化学文摘(网络版);中国科学引文数据库(2015-2016);中国科学引文数据库(2017-2018);中国科学引文数据库(2019-2020);日本科学技术振兴机构数据库;中国科技核心期刊;期刊分类:中药学
期刊热词:
药理
纳米组织工程化脊髓修复脊髓损伤(2)
【作者】网站采编
【关键词】
【摘要】组织学形态学检查:沿原切口逐层暴露原术区,观察局部大体情况,包括移植物与脊髓组织的融合程度,有无感染、瘢痕形成范围等。心室灌注固定法脊髓
组织学形态学检查:沿原切口逐层暴露原术区,观察局部大体情况,包括移植物与脊髓组织的融合程度,有无感染、瘢痕形成范围等。心室灌注固定法脊髓取材,取固定后的脊髓标本,常规石蜡包埋,连续切片,切片厚度为8 μm,进行苏木精-伊红常规染色,其中苏木精染色3 min,0.5%伊红溶液染色5 min,中性树胶封固,显微镜下观察。
新生组织中细胞成分检测:取制备好的石蜡切片,常规进行脱蜡,灭活,抗原修复处理,检测一抗包括兔抗微管相关蛋白2(MAP2)单克隆抗体(1 ∶100)、兔抗人胶质原性纤维酸性蛋白(GFAP)单克隆抗体(1 ∶200)、兔抗环核苷酸-3’磷酸水解酶(CNPase)单克隆抗体(1 ∶100),每张切片滴加一抗约100 μL,4 ℃孵育过夜,以PBS 取代一抗重复实验作为阴性对照,每张切片滴加约50 μL 生物素标记的鼠抗兔二抗(1 ∶100),37 ℃作用2 h,在 1 mL 蒸馏水中加入A、B、C 试剂各一滴,混匀后于室温下行DAB 显色,防荧光萃灭剂封固,光学显微镜下观察结果,选合适的视野拍照。
1.6 统计学分析 以 SPSS 16.0 作为统计学软件,术后第1,2,4,6,8 周的改良BBB 评分结果以±s表示,采用方差分析,P< 0.05 表示差异有显著性意义。
2 结果 Results
2.1 纳米纤维膜的表征 以扫描电镜观察并应用专用图像计算系统(哈尔滨林业大学提供)进行测量,平行排列纳米纤维膜的纤维直径为(694±157)nm,纤维排列方向大致平行;交错排列纳米纤维膜纤维的直径为(785±177)nm,纤维排列方向纵横交错[5]。
2.2 神经干细胞的培养和鉴定 脊髓源性神经干细胞初次接种后以单个存在为主,在显微镜下呈圆形(图2A),培养一两天仍以单个细胞为主,镜下可见因细胞聚集形成不规则的细胞团,经吹打即可散开。3 d 后,经细胞分裂增殖形成神经球,多呈椭圆形悬浮于培养液中,不易吹散,边界清晰,5-7 d 神经球经增殖明显,细胞数可达数百个,中心细胞因营养供应不良出现坏死表现(图2B),进行机械传代后细胞以单个及较小神经球存在,传代后细胞的增殖速度无明显变化。
经传代培养的脊髓源性神经干细胞标记后在荧光显微镜下即可见明亮的绿色荧光,又可见明亮的橙红荧光,两种荧光可合成于同一细胞。说明神经干细胞表达神经干细胞的特有标志物巢蛋白,同时表达BrdU。
2.3 脊髓半横断及术后动物情况 实验中脊髓切除范围采用宁多毋少的原则,中线右侧切除一矩形长3-5 mm 的半横断脊髓缺损区域,切除时可略过中线,尽量切除彻底,避免神经残留。术后动物双侧后肢及尾部的活动能力完全丧失,脊髓休克期后左后肢活动能力逐渐恢复,约2 周恢复自主排尿,20%-30%的动物因营养不良、自残等原因死亡,其余动物可长期存活,为进一步实验奠定了基础。
2.4 改良BBB 评分检测结果 自术后第1 周开始,各组间改良BBB 评分存在明显差异(P< 0.05),由优至劣的顺序为平行组织工程组、交错组织工程组、平行组、交错组、空白对照组。平行组织工程组术后各时间点的改良BBB 评分高于其余4 组(P< 0.05),交错组织工程组、平行组、交错组术后各时间点的评分高于空白对照组(P< 0.05);术后第1 周,交错组织工程组评分高于交错组(P< 0.05),自第2 周开始评分高于平行组、交错组(P< 0.05);平行组术后第1,2 周的评分高于交错组(P< 0.05),见表1。组织工程化脊髓组功能恢复较早且恢复程度较好,各组至第8 周起评分无改变,脊髓功能恢复出现停滞。
表1 |术后不同时间段各组大鼠BBB 评分的比较 (±s,n=20)Table 1 |Comparison of BBB scores of rats in different time periods after operation in each group表注:与空白对照组比较,aP< 0.05;与交错组比较,bP< 0.05;与平行组比较,cP< 0.05;与交错组织工程组比较,dP< 0.05组别 术后第1 周 术后第2 周 术后第4 周 术后第6 周 术后第8 周空白对照组 0. 1. 3. 7. 7.交错组 0. 2. 4. 10. 11.平行组 0. 3. 4. 10. 11.交错组织工程组0. 3. 5. 14. 15.平行组织工程组1. 4. 8. 17. 17. F 值 1.549 20.154 23.819 47.404 54.978 P 值 0.207 0.000 0.000 0.000 0.000
2.5 灌注及取材情况 灌注过程中右心耳流出液体逐渐谈澄清透明,可见大鼠肢体抽搐,腹部隆起,身体变硬,取出的脊髓标本呈白色,包括损伤区及其远近端部分,脊髓可见半横断处脊髓变细,纳米纤维膜与再生脊膜完全融合。
2.6 苏木精-伊红染色结果 术后8 周取材行苏木精-伊红染色,空白对照组损伤区域几乎无细胞结构,可见大量瘢痕组织形成,并有较多空泡出现;单纯纳米纤维膜植入后,纳米支架抑制了瘢痕组织形成,组织修复不明显,局部形成较大腔隙,邻近组织瘢痕形成,细胞稀少,损伤区与周围未建立细胞联系;纳米组织工程化脊髓植入后,可见支架降解区域内有大量细胞成分,局部有较多组织再生,细胞数量较多,细胞沿支架方向分布,彼此相关并与正常组织相连,见图3,细胞成分有待进一步鉴定。
文章来源:《中国实验方剂学杂志》 网址: http://www.zgsyfjxzzzz.cn/qikandaodu/2021/0402/548.html
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