期刊信息
主办:中国中医科学院中药研究所;中华中医药学会
主管:国家中医药管理局
ISSN:1005-9903
CN:11-3495/R
语言:中文
周期:半月
影响因子:1.817375
数据库收录:
北大核心期刊(2008版);北大核心期刊(2011版);北大核心期刊(2014版);北大核心期刊(2017版);化学文摘(网络版);中国科学引文数据库(2015-2016);中国科学引文数据库(2017-2018);中国科学引文数据库(2019-2020);日本科学技术振兴机构数据库;中国科技核心期刊;期刊分类:中药学
期刊热词:
药理
体外培养大鼠关节软骨细胞原代至第代的形态学(2)
【作者】网站采编
【关键词】
【摘要】1.4.3 软骨细胞的爬片与固定 处理时,准备6孔细胞培养板,内置20 mm直径盖玻片备用,取第3代关节软骨细胞,使用血球计数板计数,以每孔1×104细胞种植于
1.4.3 软骨细胞的爬片与固定 处理时,准备6孔细胞培养板,内置20 mm直径盖玻片备用,取第3代关节软骨细胞,使用血球计数板计数,以每孔1×104细胞种植于6孔细胞培养板底盖玻片上,37 ℃恒温、体积分数为5%CO2、饱和湿度培养箱内培养。待盖玻片上软骨细胞融合率达70%时,移液枪吸干孔内培养基,PBS反复冲洗3次,每次时间为1 min;最后在培养板各孔加入适量40 g/L多聚甲醛固定软骨细胞,将培养板置于4 ℃冰箱内长期保存备用。
1.4.4 软骨细胞增殖检测 为验证所分离出细胞的增殖能力,采用CCK-8实验检测软骨细胞的活力。取第1-5代软骨细胞进行实验观察,将培养皿中细胞用胰蛋白酶消化后以5.0×104/孔接种于96孔培养板,每代细胞各8个复孔,培养24 h时开始,浸泡于混有30 μL CCK-8检测液的300 μL工作液中,在37 ℃孵育箱中培养2 h,用酶标仪检测450 nm波长处吸光度值,连续8 d。以培养时间为横轴,吸光度值为纵轴,各组数据不同颜色标记,绘制生长曲线。
1.4.5 软骨细胞组织学检测
(1)甲苯胺蓝染色观察细胞形态:取上述第3代软骨细胞使用爬片技术,经种植软骨细胞融合率达80%时,取出培养板孔内盖玻片,PBS反复清洗3次,再取适量40 g/L多聚甲醛固定并置于4 ℃冰箱过夜。过夜后取出盖玻片,三蒸水反复冲洗3次,确定其上无前实验液体残留后,置于染色架上,轻柔添加1%甲苯胺蓝染色,静置30 min后,三蒸水洗去多余的甲苯胺蓝染液,置于体积分数为100%的无水乙醇中脱水,中性树胶封固,取正置显微镜观察拍照并记录。
(2)免疫荧光染色检测Ⅱ型胶原和蛋白聚糖表达:取上述第3代软骨细胞使用爬片技术,待细胞融合率达80%时,取出盖玻片,取PBS反复清洗3次,再浸泡于40 g/L的多聚甲醛在室温下固定20 min,0.2%TritonX-100处理细胞5 min以通透细胞膜,PBS洗涤,用含1%BSA的PBS稀释抗Ⅱ型胶原和蛋白聚糖一抗抗体,再将细胞与上述混合液(1∶100)在室温下孵育1 h,PBS洗涤,与山羊抗大鼠IgG H&L (Alexa Fluor? 488)室温下孵育1 h,PBS洗涤,细胞核用DAPI复染,PBS洗涤,用激光扫描共焦显微镜观察染色情况。
1.5 主要观察指标 ①软骨细胞形态;②软骨细胞生长曲线;③软骨细胞经甲苯胺蓝染色结果;④Ⅱ型胶原和蛋白聚糖免疫荧光染色检测结果。
2 结果 Results
2.1 软骨细胞形态 见图1。经倒置相差显微镜观察,所提取软骨细胞经分离、接种后,在显微镜下观察可见培养基中悬浮大量圆形软骨细胞,具有强折光性,此时细胞处于游离期,细胞质回缩致使整个胞体呈圆球形(见图1A)。由于软骨细胞贴壁速度较慢,12 h后开始附壁,部分细胞外形也逐渐由圆形转变为多边形和椭圆形,瓶底可见散在分布的单个细胞(见图1B)。24 h后活细胞基本上都完成铺伸,软骨细胞呈散在三角形、多角形贴附于培养皿底(见图1C)。后增殖速度明显提高,软骨细胞彼此之间伸出伪足样突起相互连接,到第5天出现复层生长趋势,细胞聚集处生长状态良好(见图1D)。第6-9天达到85%融合,原代软骨细胞形状也稳定在不规则多边形,有时可见大量细胞集中并呈放射样成簇生长。细胞增长至爬满底时软骨细胞可变为梭形,细胞内胞浆分布均匀,核大而圆。行传代处置后细胞贴壁与生长速度较之前均明显加快,六七天便可以增殖至铺满培养皿底。第2,3代细胞形态均较佳,细胞较原代大小稍有增加,梭形细胞数量也逐渐增多(见图1E,F),随着传代次数的增多,细胞形态似逐渐去分化为成纤维细胞,两端伸出数量不等的伪足,细胞形态愈发不规则,且生长速度开始下降,3代后上述特征逐渐表达明显。
2.2 软骨细胞生长曲线 见图2。CCK-8检测法绘制第1-5代软骨细胞生长曲线,可见各代细胞在培养72 h后贴壁细胞数量逐渐增加,这些梭形软骨细胞呈散在分布。实验中每一代细胞生长曲线都显示软骨细胞具有一些共性,都在接种后3,4 h出现贴壁细胞,第1-3天细胞增殖速度较慢,第3-6天细胞增殖进入对数生长期,细胞增殖呈明显加速状态,至第7天进入平台期,所以在实验中选择细胞培养7 d左右后覆盖率超过90%时进行传代。实验中可见每一代细胞形态都相对均匀,形成紧密交织的生长网络。在1-5代细胞中,第3代细胞增殖率在同一时间点略高于其他代细胞,并且对数期细胞活性更强。所以采用第3代软骨细胞进行后续实验研究,第8天开始软骨细胞生长进入抑制期。
2.3 组织学检测结果 见图3。
(1)甲苯胺蓝染色:可见第3代软骨细胞为长梭形呈放射状排布并铺满瓶底(见图3A),调整显微镜至200倍观察可见,所染细胞核呈圆形形态规整,胞浆着色稍浅呈浅蓝色,其内可见少量蓝紫色异染颗粒(见图3B)。
文章来源:《中国实验方剂学杂志》 网址: http://www.zgsyfjxzzzz.cn/qikandaodu/2021/0316/523.html